Introducción

Las bacterias que degradan hidrocarburos son ubicuas en ambientes marinos. Algunas especies de bacterias son altamente especializadas para degradar hidrocarburos y son llamadas bacterias hidrocarburíferas (1), tal como Alcanivorax (2), thalassolituus (3), Oleiphilus (4) y Oleispira (5). Ellos han evolucionado a mecanismos adaptados a varios ambientes marinos, tal como la adaptación al frío de la bacteria Oleispira antártica(6) y respuesta al estrés (radiación UV), osmoregulación y nutrientes recolectados de Alcanivorax borkumensis (2,7), y ellos juegan un mayor rol en removedor aceites contaminados marinos (1,8,9,10).

En la década pasada, estudios direccionados de los mecanismos entendimiento de bacterias de degradadora de hidrocarburos tienen primariamente enfocada sobre las enzimas involucradas en el paso inicial la oxidación de hidrocarburos, particularmente hidrocarburos de cadena corta y media (11,12,13,14). Los mecanismos de degradación asociados con los hidrocarburos de cadena larga y ramificados son menos entendidos. Quorum sensing de bacterias, transducción de señales, mecanismos quimiotácticos y de absorción involucradas y como degradación de hidrocarburos es regulado por restos virtualmente desconocidos por todos los hidrocarburos (15).

Las Especies Alcanivorax son las más importantes bacterias degradadoras de hidrocarburos en ambientes marinos (6,7,8). En agregado a A. borkumensis, A. dieselolei son otras bacterias estudiadas intensivamente en este género. La bacteria A. dieselolei puede ser encontrada en ambas regiones costeras y pelágicas, desde la superficie del río a profundidades del océano y desde áreas tropicales a polares (16,17,18,19,20). Como el tipo de cadena de A. dieselolei la cepa B5 degrada activamente numerosos hidrocarburos (C6- C36), incluyendo hidrocarburos ramificados (21,22). Lo producido recientemente como lipopeptido es un biosurfactante que acelera el consumo de aceite (23). Esta bacteria codifica un complejo sistema monooxygenasa que incluye tres membranas no hemo del grupo hierro una hidroxilasas, una proteína citocromo P450 y una monooxigenasa unión a flavina putativa (AlmA) (22). AlmA es postulada para ser responsable para la degradación de hidrocarburos de cadena larga (16).

A pesar de la rutas de utilización de hidrocarburos múltiple puede coexistir en una simple bacteria, como ellas son coordinadas es poco clara. Varios activadores transcripcionales han sido identificados en especies Acinetobacter, Alcanivorax y Pseudomonas. Estos activadores son típicamente codificados por una red de genes relacionados con una monooxigenasa (13,24,25,26,27), pero su regulación ha sido raramente investigada. En Pseudomonas aeruginosa, dos genes alk son diferencialmente expresados en respuesta a los hidrocarburos C10-C22 (26), pero el mecanismo subyacente de esta expresión diferencial es desconocido. En P. putida, genes AlkB tal vez controlados por proteína regulatoria global Crc (28). Sin embargo, el gen crc es ausente desde los genes de A. dieselolei B5 y A. borkumensis SK2 (2).

El mecanismo que controla la respuesta temprana de bacterias para hidrocarburos, tal como quórum sensing de hidrocarburos; quimiotaxis y consumo de los mismos. A pesar de que quimiotaxis de hidrocarburos ha sido observado en bacterias aisladas de Flavimonas oryzihabitans (30) y P. aeruginosa PAO1, la maquinaria subsecuente no ha sido identificada (32). En agregado, el consumo de hidrocarburos es un paso esencial antes de la utilización, pero el mecanismo por cómo se consume es también desconocido. Este ha sido propuesto que el consumo directo de hidrocarburos soluble es facilitado por surfactantes (13). Por hidrocarburos aromáticos, ciertos factores que permiten el transporte alrededor de la membrana externa han sido identificados (33,34,35,36).

A Partir de la ruta de oxidación terminal iniciada por las enzimas hidrolasas AlkB y citocromo P450, la mayoría de la redes remanentes indeterminadas, incluyen quorum sensing de hidrocarburos, quimiotaxis, regulación diferencial de transporte transmembrana. Para entender la respuesta temprana que ocurre en presencia de hidrocarburos, hemos creado una biblioteca de genoma mutante azaroso de A dieselolei B5. Usando la biblioteca mutante, visualizamos e identificamos genes en bacterias mutantes con crecimiento anormal en presencia de diferentes hidrocarburos. Fomentamos roles determinados de genes mutados en quorum sensing de hidrocarburos; quimiotaxis y consumo de los mismos, y regulación, coordinación de rutas de utilización de diferentes hidrocarburos.

Figura 1: Propuesta la ruta de degradación de hidrocarburos de cadenas largas. Tomada de nature. Foto tomada de nature communications de trabajos de Wanpeng Wang

Zongze Shao

 

Genes involucrados en utilización de hidrocarburos de cadenas largas en la cepa B5

Usando métodos de alto impacto, cepas mutantes fueron identificado desde la biblioteca de mutante que exhibieron crecimiento anormal (ausencia o aumentado) C32 como fuente de carbono pero crecimiento tipo salvaje con acetato como fuente de carbono, inserción por transposón correspondientes a genes interrumpido (13 en total) fueron identificado en estos mutantes. los genes interrumpidos codificados en una monooxigenasa putativa. Dos proteínas involucradas en la regulación, dos proteínas involucradas en secreción, tres proteínas involucradas en quimiotaxis, tres proteínas responsables para transportación de ácido grasos de cadenas largas y dos proteínas con función desconocida. Una búsqueda en Blast reveló que más de los genes son homólogo en cepas de Alcanivorax tal como A. borkumensis SK2, por cómo el genoma completo ha sido secuenciado (2), experimento complementación resultado confirman que deficiencia de degradación de hidrocarburos de cadenas largas de los mutantes anteriores fueron no causado por un efecto polar sobre los genes río abajo de los correspondientes genes interrumpidos.

AlmA, una monooxigenasa que hidroxila hidrocarburos

En una cepa mutante (MAB5) que es incapaz de utilizar hidrocarburos de cadenas largas, identificamos una inserción en el gen AlmA. El gen AlmA ha sido anotado como codificación de una monooxigenasa. tres marcos de lectura almA habían sido anotados como una hidrolasa, un hipotético proteína reguladora y transportador de ácidos grasos de cadena larga. Para verificar la función de almA en utilización de hidrocarburos, el crecimiento de cepa mutante MAB5 fue ensayado usando varios hidrocarburos como fuente de carbono basado en observación de cultivo celular. El resultado indicó que la cepa mutante no hizo crecer sobre los hidrocarburos C32 o C36; creció en peor sobre los hidrocarburos C24, C28 y pristano; creció normalmente sobre los hidrocarburos C8, C12 y C16. Esto busqueda sugerido que AlmA fue responsable por la utilización de hidrocarburos cadenas largas o ramificado en la cepa MAB5.

Para más verificación de la función del gen almA, esta fue expresada heterologamente. La proteína AlmA fue entonces subjetiva a un ensayo de actividad enzimática usando varios hidrocarburos. El producto de transformación de hidrocarburos obtenida revela que la proteína AlmA purificado convierte hidrocarburos C14-C36 y pristano a su correspondiente alcoholes primarios, como vía de determinación de cromatografía gaseosa y espectrometría de masas. Una actividad altamente específica fue observada sobre hidrocarburos C24- C36 y pristano, y una actividad específica fue observada sobre hidrocarburos C10, C12 y C14.   

AlmR, gen de proteína regulatoria de metabolismo de hidrocarburos de cadenas largas

En la biblioteca mutante, la cepa MRB5 exhibida más que el crecimiento que cepa salvaje cuando un hidrocarburo C32 fue usado como fuente de carbono. En este mutante, un gen fue identificado río arriba de y en alguna orientación como AlmA. Este gen codifica una hipotética proteína que desplegada 61% identidad para un homólogo desde la cepa SK2 y carece de 40% homología a secuencia desde otra cepas disponible en GenBank. Siguiendo la caracterización detallada permite, hemos designado este gen AlmR, un gene de una proteína reguladora del metabolismo de hidrocarburo.

Para definir la función de almR, la cepa mutante MRB5 fue proporcionada con sustrato de varias longitudes. interrupción de este gen no hizo efecto significativo al crecimiento de la bacteria en la presencia de hidrocarburos de cadena media o corta tales como C8, C12, C16 y C24. Inactivación de almR resultado en crecimiento potenciado de hidrocarburos de cadenas largas, incluyendo C28, C32, C36 y pristano, comparado con la cepa salvaje; entre cuatro hidrocarburos, sin embargo la mutación condujo a más marcadamente crecimiento potenciado sobre C32. 

La expresión del mRNA de almR en cepa B5 salvaje en respuesta a diferentes hidrocarburos fue cuantificado por PCR. La expresión almR fue encontrada para ser desregulación relativa respecto al control acetato cuando los hidrocarburos C8, C12 o C16 fueron usados como fuente de carbono. En contraste, inducción fue no observada cuando C24, C32 o pristano fueron usados, y la expresión almR fue de hecho, significativamente desregulado por C32 y pristano.

El curso temporal de la expresión de almA y almR fue monitoreado desde la fase lag a la fase estacionaria de crecimiento en la cepa salvaje B5 creciendo sobre pristano o C32. La expresión de almA fue robustamente inducida por ambos sustratos sólo durante la fase exponencial. En cambio, la expresión de almR fue significativamente inhibida por C32 y pristano durante la fase exponencial. Notablemente, en la cepa mutante MRB5, la expresión potenciada de almA ocurrió a pesar de todo en la presencia o ausencia de hidrocarburos.

Intervención de cyoD en la modulación del metabolismo de hidrocarburos 

La cepa mutante CYB5, como es incapaz para degradar C32, exhibir una copia interrumpida de cyoD, la subunidad de citocromo o ubiquinol oxidasa (cyo), como regulador transcripcional global putativo. En la cepa mutante CYB5, el fragmento conteniendo el gen cyoD y este flanqueando la región fue secuenciado el extremo terminal mayor a 4,5 kb y después confirmado por secuenciación.

Ensayos de crecimiento realizados en la cepa mutante CYB5 en la presencia de varios hidrocarburos demostrando que la interrupción del gen cyoD decrece el crecimiento significativamente sobre C32, C36 y pristano y modestamente reducido el crecimiento sobre C28. En contraste, la cepa mutante CYB5 crece vigorosamente más que la cepa salvaje B5 sobre los hidrocarburos con longitud C8- C24 incluido C12 y C16. Q-PCR reveló que la expresión cyoD fue significativamente desregulada (13-18% como fuente de carbono) cuando la cepa B5 fue creciendo usando C8, C12, C16 o C24 como fuente de carbono. Mientras este fue desregulado en la presencia de C28, C32 y pristano. la cuantificación de los datos de expresión indica que cuando cyoD fue interrumpida en la mutante, almR fue constitutivamente expresado a un muy alto nivel más que en la cepa salvaje B5. 

Los roles de mcp, cheR y cheW en la utilización de hidrocarburos

En la biblioteca mutante, tres genes fueron identificados en un operón. Estos genes codifican la proteína aceptora de metilos (mcp, una metiltransferasa (cheR) y una proteína transductora de señal (cheW). Interrupción de algunos de estos genes significativamente reducida por crecimiento bacteriano en la presencia de C32. Los genes flanqueando las inserciones contienen el juego completo de proteínas quimiotaxis sin región específica. Esta región mpc comprime ocho genes codificando proteínas citoplasmática, incluyendo mpc, cheW, cheA, cheY, cheR y cheB. interesantemente, dos homólogos cheW y cheY fueron encontrados en alguna región. 

Para el entendimiento de los roles de mcp, cheR y cheW en hidrocarburos metabolizados, el crecimiento de cepas deficiente fue ensayado en presencia de varios hidrocarburos. cuando mcp o cheR fue interrumpido, el crecimiento fue decreciendo significativamente en presencia de todos los hidrocarburos probados. Interesantemente, la disrupción de cheW inhibió el crecimiento en presencia de hidrocarburos más cortos que C24.

Expresión de genes quimiotaxis en respuesta a hidrocarburos

El resultado de la PCR cuantitativa revela que mcp, cheA, cheB, cheR y cheY fueron desregulado en cepa salvaje B5 cuando crecían sobre los hidrocarburos C8-C32 o pristano respecto al control (acetato). En contraste, la expresión cheW fue significativamente inducida en la cepa B5 solo en la presencia de los hidrocarburos C8- C24, mientras la expresión de cheW aumenta significativamente en la presencia de pristano y hidrocarburos más largos que C24. Interesantemente, cuando gen cyoD fue interrumpido, los niveles de expresión de mcp, cheA, cheB, cheR cheY y cheW fueron la misma como en la cepa salvaje B5. En agregado, cuando mcp fue interrumpido, cyoD y almR fueron expresados en el mismo nivel como en la cepa salvaje B5. Sin embargo, cuando la expresion de cheW fue interrumpida en cepa mutante CWB5, sin induccion de cyoD por hidrocarburos largos (C28-C32) y pristano ocurrido; en cambio, la expresion cyoD fue significativamente reprimido. En cambio, la interrupción del gen cyoD sin efecto sobre la expresión cheW,  

Los roles de mcp, cheR y cheW en la quimiotaxis de hidrocarburos

El comportamiento de quimiotaxis de hidrocarburos en la cepa salvaje B5 y tres cepas mutantes fue evaluada a través de ambas capilaridad y ensayos densitométricos. Los resultados cuantitativos de estos dos métodos fueron comparables. La técnica densitométrico proporciona datos cuantitativos sobre la tasa de moción sobre varios alcanos. Para la cepa salvaje B5, la velocidad de moción en la presencia de diferentes hidrocarburos está en rango desde 0,43 mm min-1 por C32 a 0,97 mm min-1 por C16. SIn embargo, las cepas mutantes MCB5, CRB5 y OMB5, insignificante detección quimiotaxis fue observado hacia algún de las pruebas en alcanos, la cepa mutante CWB5, la velocidad grabada fueron 0,82 y 0,89 mm min-1 en la presencia de C12 y C16 respectivamente, pero insignificante atracción quimiotáctica fue observada en la presencia de los hidrocarburos C24, C32 y pristano. Resultado similar fue obtenido en ensayos de capilaridad. Todo genes contribuyeron para observar comportamiento quimiotáctico, pero cheW fue específico para hidrocarburos de cadena larga y ramificado. En agregado, hirocarburos a 20°C. Los resultados muestran que mcp encontró a todos los hidrocarburos probados (hidrocarburos C8-C32 y pristano) pero no a acetato. 

La expresión de tres OmpTs

Un gen que codifica una proteína transportadora de membrana externa fue identificado tio arriba de almR en alguna orientación. El transposón mutante visualizado resulta aislado de dos mutantes adicionales, ompT-2. Las tres proteínas OmpT fueron más cercanas relacionadas a transportadores de ácido grasos putativo encontrados en Alcanivorax. Ellos mostraron ser altamente similares, 67,50 y 67% a la correspondiente homólogos de Alcanivorax sp. El análisis Q-PCR indicó que la expresión de ompT-1 fue fuertemente desregulado por los hidrocarburos C24-C32 y pristano en la cepa B5, mientras este fue solo inducido débilmente por los hidrocarburos de cadena media y corta (C8-C16). Sin embargo, ambos ompT-1 y ompT-3 fueron significativamente inducidos por todos los hidrocarburos probados, incluidos los hidrocarburos C8-C32 y pristano. 

Interesantemente, la interrupción de almR incrementó la expresión de ompT-1 en ambos en la ausencia y presencia de hidrocarburos, indicando que almR desregula la expresión de ompT-1. La expresión de ompT2 y ompT-3 en el mutante almR fue también analizado, y la interrupción de almR no tuvo influencia en la expresión de ampT-2 o ompT-3. En agregado, la interrupción del gen cyoD condujo a la expresión constitutiva de ompT-2 y ompT-3 en la cepa CYB5 en ambos ausencia y presencia de hidrocarburos (cadena corta o larga o ramificado), sugiriendo que cyoD desregula la expresión de ompT-2 y ompT-3.

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