Estructura del complejo Cas9CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) son segmentos de ADN procariota que contienen secuencias cortas repetidas. Cada repetición va seguida de un segmento llamado “ADN espaciador” producto de una exposición previa a virus o plásmidos bacterianos.

CRISPRs y CRISPR-asociados (Cas) son genes que codifican proteínas que forman parte del sistema inmune de algunos organismos y son esenciales para la inmunidad adaptada o adquirida, ya que les permite eliminar selectivamente cierto material genético, como por ejemplo, aquel que deriva de virus.

Crispr

https://en.wikipedia.org/wiki/File:Crispr.png

Cas reconoce y corta ese material genético exógeno en fragmentos de unos 20 pares de bases, de forma similar a como ocurre con el ARN de interferencia en eucariotas; es decir, forma una doble hélice específica para esa secuencia con el material que se va a cortar y procede a su eliminación. El ADN invasor se reconoce por una secuencia de terminación de 3-5 pares de bases que se coloca al final y que se llama PAM (protospacer adjacent motif). PAM es como una banderita roja que indica a Cas dónde se encuentra la secuencia extraña.

Basándose en este sistema biológico, algunos investigadores de mente brillante han conseguido desarrollar una herramienta molecular de incalculable valor, mediante la cual es posible editar el genoma de forma controlada. Esta herramienta, conocida como CRISPR/Cas9 consiste básicamente en la creación de un sistema CRISPR dirigido contra una determinada secuencia del genoma como si fuera una secuencia exógena. Para ello, han aislado la proteína Cas9 de la bacteria Streptococcus pyogenes.

Cualquier secuencia de 20 pares de bases en algún lugar del genoma que termine con una secuencia PAM al final, podrá ser potencialmente utilizada para editar el ADN que la rodea. Esta secuencia de 20 pares de bases será la que guíe a la enzima Cas9 para saber dónde tiene que cortar, por eso se conocen como ARN guía (gRNA). De esta forma, podemos introducir cortes en zonas puntuales del genoma de una célula. En principio estos cortes serán roturas de doble hebra, lo que significa que las dos hebras de ADN se romperán. La maquinaria celular tenderá a reparar esta rotura uniendo los extremos cortados utilizando el sistema de unión de extremos no homólogos y dando lugar a microdeleciones que provocarán errores de lectura, y por consiguiente, la inactivación de ese gen.

Recombinación homóloga y no homóloga después de la rotura del ADN.

Recombinación homóloga y no homóloga después de la rotura del ADN.

Sin embargo, si además de introducir el sistema CRISPR/Cas9 en la célula, se introduce también una hebra de ADN “donante” que contenga la misma secuencia que la hebra parental pero con un cambio puntual (por ejemplo, un cambio de base), un pequeño porcentaje de células serán reparadas utilizando la hebra donante como patrón, por lo que serán editadas siguiendo nuestro diseño.

El mayor problema que presenta este modelo de ingeniería genética es lo que se conoce como “off-target effect” que vienen a ser efectos secundarios no deseados. Es decir, cualquier secuencia del genoma que contenga nuestra guía con la misma PAM al final, también será cortada; y si está localizada en la parte codificante de un gen, puede que lo inactive.

Para disminuir este efecto, se han creado las Cas9 nickasas (Cas9n), que son proteínas Cas9 mutantes que sólo producen corte en una de las dos hebras de ADN. Para poder editar genes con Cas9n, se necesitan dos gRNAs para guiar a dos Cas9n diferentes. Uno de ellos se unirá a la hebra molde y otro a la hebra complementaria, produciendo así una rotura con extremos cohesivos en lugar de romos. En este caso, la reparación por recombinación homóloga (es decir, usando como molde el trozo de hebra que sobresale) es mucho más precisa y da lugar a menos errores. Igual que en el caso de la enzima Cas9 normal, se puede añadir una hebra de ADN donante para que la reparación ocurra como una recombinación homóloga en la que los extremos cohesivos se acoplarán a la hebra donante para copiarla. En la mayor parte de los casos, la maquinaria celular reparará la rotura utilizando la hebra complementaria que ya existía y dará lugar a la secuencia original; pero un pequeño porcentaje de células utilizarán como molde la hebra donante y darán lugar a una secuencia de AND editada con la mutación que hayamos querido introducir. Esto significa, por ejemplo, que se pueden rectificar mutaciones, cortando la secuencia mutante del gen correspondiente y añadiendo una secuencia donante con las bases correctas.

¿Cómo se introduce Cas9, las guías gRNA y la hebra donante en una célula?

Se utiliza un plásmido o ADN circular que contiene el gen que codifica la proteína Cas9, así como las hebras gRNA. Se transfectan las células eucariotas utilizando liposomas o electroporando la membrana (haciendo agujeros).

¿Cómo se separan las células que se han editado de las que no?

El plásmido contiene también un gen de selección, que puede ser una proteína de color verde, que hará que las células que lo adquieran sean verdes fluorescentes, o un gen de resistencia a antibiótico, mediante el cual sólo las células transfectadas sobrevivirán en un medio que lo contenga. De esta manera, se pueden seleccionar las células que han incluido el plásmido y por tanto, pueden ser potencialmente editadas.

Softwares para predecir guías

En los últimos meses, se han desarrollando decenas de programas informáticos capaces de localizar estas secuencias PAM a lo largo del genoma y capaces, por tanto, de predecir los mejores lugares para diseñar las guías. Ya se han conseguido editar genes en líneas celulares humanas y de otros organismos, así como en células madre.

La gran versatilidad de esta herramienta nos permite soñar con la reparación de mutaciones que producen enfermedades hereditarias o tan graves como el cáncer, distrofias musculares, Alzheimer, Parkinson, etc. La ventaja sobre cualquier otra herramienta existente es que es un cambio irreversible y controlado, es decir, una vez que una mutación se repara en el ADN, todas las células derivadas de ésta, serán normales. Es una herramienta tan potente que ha de ser utilizada con sumo respeto e incluso miedo. Por ejemplo, se podría utilizar para corregir errores genéticos en embriones que darían lugar a herencia mendeliana. Aunque aún estamos lejos de tales hitos, es cierto que la era de la medicina molecular ha comenzado, puesto que tenemos en nuestras manos una potencial cura para muchas enfermedades degenerativas o para, al menos, llegar a conocer un poco mejor los mecanismos que las provocan. Además, es una herramienta magnífica para estudiar la causa genética de enfermedades cuya etiología es aún desconocida.

Fuentes

Addgene

http://blog.addgene.org/the-pam-requirement-and-expanding-crispr-beyond-spcas9

http://blog.addgene.org/adenoviral-delivery-of-crisprcas9-aims-to-expand-genome-editing-to-primary-cells

Pubmed

CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Mali P, Aach J, Stranges PB, Esvelt KM, Moosburner M, Kosuri S, Yang L, Church GM. Nat Biotechnol. 2013 Sep;31(9):833-8. doi: 10.1038/nbt.2675. Epub 2013 Aug 1.

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